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近日，Science China Life Sciences（《中国科学：生命科学（英文）》）在线发表了哈尔滨工业大学黄志伟教授团队的研究成果“Inhibition mechanisms of CRISPR-Cas9 by AcrIIA25.1 and AcrIIA32”。该团队通过解析AcrIIA25.1和AcrIIA32结合SpyCas9监视复合物的冷冻电镜结构，阐述了AcrIIA25.1和AcrIIA32蛋白抑制SpyCas9的分子机制。
SpyCas9作为目前应用最为广泛的基因编辑工具，研究能够有效调控它的CRISPR抑制蛋白（Acr）显得尤为重要。近期，两种新的Acr蛋白——AcrIIA25.1和AcrIIA32，被发现能够在细菌和人类细胞中有效抑制SpyCas9的活性，但是它们的抑制机制还不清楚。研究团队首先利用单颗粒冷冻电镜解析了AcrIIA25.1和AcrIIA32蛋白分别结合SpyCas9-sgRNA的复合物结构。
SpyCas9-sgRNA-AcrIIA25.1 和 SpyCas9-sgRNA-AcrIIA32的冷冻电镜结构
A，SpyCas9 蛋白的结构域组织图。B，SpyCas9-sgRNA-AcrIIA25.1复合物的结构。C，SpyCas9-sgRNA-AcrIIA32复合物的结构。图中SpyCas9 蛋白各个结构域的颜色同（A）中所示。AcrIIA25.1 和 AcrIIA32蛋白分别以粉色和蓝色显示。
通过结构分析，发现AcrIIA25.1和AcrIIA32分别识别了一个新的之前未被鉴定的SpyCas9结合表面。研究人员通过设计基于结构观察的丙氨酸突变，结合体外酶切和GST pull down实验，验证了结构的正确性。进一步结构分析，发现AcrIIA25.1和AcrIIA32蛋白主要通过和WED结构域的直接相互作用，阻碍了WED结构域和相邻的PI结构域向激活状态的变构，从而阻碍了对PAM序列的识别以及对双链DNA的解螺旋，最终抑制了SpyCas9对底物DNA的识别和结合。此外，AcrIIA32和REC1结构域的相互作用，可能也对REC裂片的激活变构有抑制作用，影响了R-loop的形成，增强了AcrIIA32的抑制能力。
最后，研究人员还基于结构观察讨论了AcrIIA25.1和AcrIIA32蛋白除了可以抑制SpyCas9对靶DNA的结合以外，同时还可以抑制SpyCas9酶切活性的可能的分子机制。他们认为，SpyCas9是一个复杂的多结构域的蛋白，在依次结合sgRNA、底物DNA到最后剪切双链DNA的过程中，各个结构域之间会发生复杂而精密的构象变化。然而，由于AcrIIA25.1和AcrIIA32结合到了SpyCas9表面的两个凹槽中，并且同时和多个结构域之间有相互作用，因此它们的结合可能阻碍了SpyCas9蛋白剪切底物过程所必须的机械变构，最终降低了SpyCas9的酶切活性。
总之，该研究利用结构生物学的手段，阐述了AcrIIA25.1和AcrIIA32蛋白可以抑制多种状态SpyCas9的分子机制，提高了对噬菌体反制细菌CRISPR系统的机制多样性的理解，也为有效调控SpyCas9的活性提供了新的思路。
